Öffentliche Datenanalyse

Daten zu SARS-CoV-2-Linien und das Datum, an dem die Probe aus den aus Chile verfügbaren Sequenzen entnommen wurde, wurden von der Consorcio Genomas CoV2-Site bezogen unter https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Die Impfdaten stammen aus öffentlichen Daten des Ministeriums für Wissenschaft, Technologie, Wissen und Innovation, verfügbar unter https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Produkt 83).

Infektiositätstest

Pseudotypisierte Viren, die verschiedene SARS-CoV-2-Spike-Proteine tragen, wurden wie zuvor beschrieben hergestellt¹². Kurz gesagt, HIV-1-basierte SARS-CoV-2-Pseudotypen wurden in HEK293T-Zellen durch Transfektion des pNL4.3-ΔEnv-Luc zusammen mit dem entsprechenden pCDNA-SARS-CoV-2 Spike-Kodierungsvektor in einem 1:1-Molverhältnis hergestellt. Plasmide, die einen Codon-optimierten Spike codieren, dem die letzten 19 Aminosäuren des C-terminalen Endes (SΔ19) fehlen, von denen bekannt ist, dass sie eine Retention am endoplasmatischen Retikulum vermeiden¹² wurden durch Gensynthese oder angepasste ortsgerichtete Mutagenese (GeneScript) erhalten und enthielten die folgenden Mutationen: Linie A (Referenzsequenz), Linie B (D614G), Linie B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), Abstammung P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I) und Abstammung C.37 (G75V, T76I, Δ246 252, L452Q, F490S, D614G, T859N). Jedes Pseudotyppräparat wurde durch Zentrifugation bei 3,000 U/min bei Raumtemperatur geklärt, mit dem HIV-1 Gag p24 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems) quantifiziert, in 50 % fetalem Rinderserum (Sigma-Aldrich) aliquotiert und bei -80 °C bis . gelagert benutzen. Zur Infektion von HEK-ACE1-Zellen wurden unterschiedliche Mengen pseudotypisierter Viren (bestimmt durch die Spiegel des HIV-24-p2-Proteins) verwendet und 48 Stunden später wurde die Luciferase-Aktivität des Glühwürmchens mit dem Luciferase-Assay-Reagenz (Promega) in einer Glomax 96-Mikrotiterplatte gemessen Luminometer (Promega).

Neutralisationsassay

Pseudotypisierte Virusneutralisationsassays wurden im Wesentlichen wie zuvor beschrieben durchgeführt¹². Kurz gesagt wurden serielle Verdünnungen der Plasmaproben (1:4 bis 1:8748) in DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum hergestellt und mit 5 ng p24 jedes pseudotypisierten Virus während 1 h bei 37 °C und dann 1 × 10 . inkubiert⁴ von HEK-ACE2-Zellen wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Als Negativkontrolle wurden HEK293T-Zellen (kein ACE2 exprimierend) inkubiert mit dem pseudotypisierten Virus (Linie A) verwendet. Die Zellen wurden 48 Stunden später lysiert und die Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung des Luciferase-Assay-Reagenz (Promega) in einem Glomax 96 Mikroplatten-Luminometer (Promega) gemessen. Der Neutralisationsprozentsatz für jede Verdünnung wurde berechnet und der ID50 jeder Probe wurde mit GraphPad Prism Version 9.0.1 berechnet.

Statistische Analysen

Statistische Analysen wurden mit der GraphPad Prism-Softwareversion 9.1.2 durchgeführt. Mehrere Gruppenvergleiche für neutralisierende Antikörpertiter (NAbTs) gegen ein Panel von SARS-CoV-2-Pseudotypviren sowie Vergleiche der NAbs-Antworten nach Geschlecht und Rauchstatus wurden unter Verwendung eines gepaarten Wilcoxon-Vorzeichentests durchgeführt. Die Faktoränderung wurde als Differenz des geometrischen Mittelwerts des Titers im ID . berechnet₅₀ verglichen mit dem des pseudotypisierten Wildtyp-Virus. Die Korrelationsanalyse zwischen NAbTs und Alter oder BMI wurde unter Verwendung des Spearman-Tests durchgeführt. Zur statistischen Analyse der Infektiosität wurden eine Einweg-ANOVA und der Mehrfachvergleichstest nach Tukey durchgeführt. Ein p-Wert ≤ 0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ethische Genehmigung

Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universidad de Chile (Projekte Nr. 0361-2021 und Nr. 096-2020) und der Clínica Santa Maria (Projekt Nr. 132604-21) genehmigt. Alle Spender unterschrieben die Einverständniserklärung und ihre Proben wurden anonymisiert.

Einfluss der Spike-Mutationen in der Lambda-Variante auf die Infektiosität und neutralisierende Antikörperreaktionen

Eine Analyse von 3695 Sequenzen aus Chile, die am 24. Juni bei GISAID hinterlegt sind^th 2021 zeigt eine deutliche Dominanz der SARS-CoV-2-Varianten Gamma und Lambda während des letzten Trimesters, die zusammen 79% aller Sequenzen ausmachen.

Interessanterweise war dieser Zeitraum von einer massiven Impfkampagne geprägt, bei der 65.6% der Zielpopulation (18 Jahre und ältere Personen) bis zum 27. Juni ein vollständiges Impfprogramm erhalten haben^th 2021

Angesichts der Tatsache, dass 78.2 % der Personen, die mit einem vollständigen Schema geimpft wurden, den inaktivierten Virusimpfstoff CoronaVac von Sinovac Biotech erhielten, versuchten wir, den Einfluss der in der Lambda-Variante vorhandenen Spike-Mutationen auf die Neutralisationskapazität der durch diesen Impfstoff ausgelösten Antikörper zu untersuchen.

Dazu generierten wir HIV-1-basierte SARS-CoV-2-pseudotypisierte Viren, die das Spike-Protein aus der Wuhan-1-Referenzlinie (Wildtyp; Linie A), der D614G-Mutation (Linie B) und dem Alpha (Linie B) tragen .1.1.7), Gamma (Linie P.1) und Lambda (Linie C.37) Varianten.

Während der Viruspräparation haben wir durchweg beobachtet, dass Zellen, die mit dem pseudotypisierten Virus, das den Lambda-Spike trägt, infiziert sind, im Vergleich zur D614G-Mutante oder den Alpha- und Gamma-Varianten signifikant höhere Biolumineszenzwerte erzeugten, was auf eine erhöhte Infektiosität getrieben durch das Lambda-Spike-Protein hinweist

Abbildung 1.Durch verschiedene Spike-Proteine vermittelte Infektiosität.

(A) Schematische Darstellung des SARS-CoV-2-Spike-Proteins und der in dieser Studie verwendeten Varianten. Abstammungslinien sind in Klammern angegeben. RBD, Rezeptorbindungsdomäne, CM; zytoplasmatischer Schwanz.

(B) Titration der Pseudotypen jeder Abstammungslinie unter Verwendung äquivalenter Mengen von HIV-1 p24. Die Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde als relative Lumineszenzeinheiten (RLU) 48 Stunden nach der Infektion gemessen. Der Durchschnitt und die SD wurden aus einem repräsentativen Dreifach-Experiment berechnet.

Als nächstes verwendeten wir die oben erwähnten pseudotypisierten Viren, um Neutralisationsassays mit 79 Plasmaproben von gesunden Gesundheitspersonal der Universidad de Chile und der Clínica Santa María in Santiago, Chile, durchzuführen.

Wir haben 4 Proben ausgeschlossen, da wir keinen ID50-Titer berechnen konnten. Von den analysierten Proben entsprachen 73 % Frauen, Durchschnittsalter 34 Jahre (IQR 29 – 43) und einem Body-Max-Index (BMI) von 25 (IQR 22.7 – 27). 20.5% der Teilnehmer gaben an, während der Impfzeit aktive Raucher zu sein. Die Proben wurden im Median 95 Tage (IQR 76 – 96) nach der zweiten Dosis des CoronaVac-Impfstoffs entnommen

Wir beobachteten, dass die Neutralisation des pseudotypisierten Virus, das das Wildtyp-Spike-Protein trägt, zu einer 50%igen Hemmverdünnung (ID₅₀) mittlerer Titer von 191.46 (154.9 – 227.95, 95-%-KI), während er 153.92 (115.68 – 192.16, 95-%-KI), 124.73 (86.2 – 163.2, 95-%-KI), 104.57 (75.02 – 134.11, 95-%-KI) betrug ) und 78.75 (49.8 – 107.6, 95 % KI) für pseudotypisierte Viren, die das Spike-Protein der D614G-Mutante bzw. der Alpha-, Gamma- und Lambda-Varianten tragen.

Wir haben auch beobachtet, dass der geometrische mittlere Titer der ID₅₀ Titer um den Faktor 3.05 (2.57 – 3.61, 95 % KI) für das pseudotypisierte Virus mit Lambda-Spike, 2.33 (1.95 – 2.80, 95 %-KI) für Gamma-Spike, 2.03 (1.71 – 2.41, 95 %-KI) für den Alpha-Spike und 1.37 (1.20 – 1.55, 95 % KI) für den D614G-Spike im Vergleich zum Wildtyp-Spike.

In unserer Studienkohorte wurde keine Korrelation zwischen Geschlecht, Alter, Body-Mass-Index (BMI) oder Rauchstatus und neutralisierenden Antikörpertitern beobachtet.

Abbildung 2.Neutralisationsassay mit Plasmaproben von CoronaVac-Impfstoffen

(A) Änderungen des reziproken 50 % Neutralisationstiters (ID₅₀) in Plasmaproben von 75 Empfängern des CoronaVac-Impfstoffs gegen D614G (Linie B), Alpha (Linie B.1.1.7),

Gamma (Linie P.1) und Lambda (Linie C.37) Varianten im Vergleich mit Wildtyp-Virus. Die Ergebnisse werden als Differenz der Neutralisationstiter von übereinstimmenden Proben gezeigt. P-Werte für den Vergleich der ID₅₀ werden mit Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test berechnet.

(B) Boxplots zeigten den Median und den Interquartilsabstand (IQR) von ID₅₀ für jedes pseudotypisierte Virus. Faktoränderungen werden als Differenz des geometrischen Mittelwerts des Titers im ID . angezeigt₅₀ verglichen mit denen für das pseudotypisierte Wildtyp-Virus. Statistische Analysen wurden unter Verwendung des Wilcoxon Matched-Pairs-Vorzeichen-Rang-Tests durchgeführt.

Zusammen zeigten unsere Daten, dass das Spike-Protein der neu erkannten interessanten Variante Lambda, die in Chile und südamerikanischen Ländern stark zirkuliert, Mutationen trägt, die eine erhöhte Infektiosität und die Fähigkeit verleihen, neutralisierenden Antikörpern zu entkommen, die durch CoronaVac ausgelöst werden.